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蛋白互作

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ChIP

货号:GM1008

品牌:Servicebio

价格:¥5000

规格:

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  一、项目介绍

  ChIP 是目前唯一研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的方 法,它不仅可以检测体内反式作用因子与 DNA 的相互作用, 还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。

  二、ChIP实验步骤

  第一天:

  (一)、细胞的甲醛交联与超声破碎

  1、取出1平皿细胞(10cm平皿),加入190ul 37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%。(培养基共有7ml,加完之后轻轻摇晃一下,使甲醛分布均一些)

  2、37℃孵育10min。(恒温培养箱,培养箱要提前开启)

  3、终止交联:加 350ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。

  4、吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞3次。

  5、用PBS将细胞刮下来,2000g离心5min,去上清。

  6、加入含蛋白酶抑制剂的SDS裂解液(或IP裂解液)裂解细胞(裂解液的量视细胞沉淀量而加,一般50ul左右的沉淀加400-600ul的裂解液)。

  7、冰上充分裂解30min,裂解过程中用枪反复吹打细胞(或者放在漩涡混匀器上震荡),使其充分裂解。

  8、超声破碎:宁波新芝 JY 92-IIN,2#探头,20%功率,4.5S超声,10.5S间隙。4min, 总计超声次数16次。超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中,避免超声出现泡沫,并且处于较低温度(超声的时间和功率可以根据超声的效果进行调整,不同的细胞及细胞量超声所需的时间略有差异)。

  (二)、除杂及抗体孵育

  1、超声破碎结束后,12000rpm, 4℃,离心10min。去除不溶物质,取上清。留取2份50ul做input,其余保存于-80℃。(input实验分为WB检测和pcr加测+超声效果检测)

  2、取1份50ul超声破碎后产物,加入1ul的蛋白酶K和2ul 5M NaCl(NaCl终浓度为0.2M),55℃过夜解交联。

  3、解交联结束后,测核酸浓度,取部分样品进行PCR扩增,然后跑电泳,检测超声破碎的效果和确认样品中含有目标DNA,同时将另外一份input蛋白变性跑WB,确认样品中含有目标蛋白

  4、取100ul的超声破碎产物,加入900ul 含1mM-PMSF的ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC(cooktail)。再各加入60ul Protein A +G Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h(珠子和鲑鱼精DNA加之前要充分混合均匀)。

  1h后,在4度静置10min沉淀,4000rpm离心5min,取上清。

  5、一管中加入目的蛋白ChIP级别抗体1μg,另一管中加入对应种属的IgG 1μg。4度颠转过夜。

  第二天:

  (一)、免疫复合物的沉淀及清洗

  1、孵育过夜后,每管中加入80ul Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA,4度颠转2h。

  2、4度静置10min后,4000rpm离心1min。除去上清。

  3、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,轻轻颠倒, 4000rpm 3次,4000rpm离心3min,除去上清。

  洗涤溶液:a. low salt wash buffer----one wash

  b. high salt wash buffer-----one wash

  c. LiCl wash buffer------one wash

  d. TE buffer------two wash

  注:完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于Western检测,在完成所有的洗涤步骤后,取30ul样品加入30ul SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X),沸水浴煮沸10分钟后上样进行WB。

  4、现配Elution buffer(0.5gSDS+0.42gNaHCO3+50ml水),加500ul至沉淀;

  5、加5M NaCl 20μL,Protease K 1μL,65度过夜解交联

  第三天:

  (一)、DNA样品的回收

  1、回收DNA。(酚LF提取法)。

  2、即加等体积酚LF,震荡,12000rpm x5min,,吸上层液体,

  3、+1/10体积3M CH3CooNa+预冷无水乙醇1mL,混匀,

  4、4度12000 RPM,15 min,弃上清,+-20℃预冷70%乙醇1ML,颠倒混匀,室温12000 RPM ,离心5 min ,弃上清,待沉淀干燥透明,+20 μL 纯水溶解。

  (二)、PCR分析

  设计引物进行PCR或者荧光定量PCR分析。