赛维尔生物服务、银河在线娱乐资料库

赛维尔生物

TEL:400-6027-178

赛维尔生物

蛋白互作

  1. 银河电子游戏
  2. 全部分类
  3. 服务
  4. 蛋白
  5. 蛋白互作
  6. 内容

EMSA检测

货号:GM1010

品牌:Servicebio

价格:¥3000

规格:

附件下载地址: ×

一、项目介绍

EMSA 是一种用于研究核酸和蛋白质之间相互作用的技 术,适用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,主要是 验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性,从而间接推断已知蛋 白质的靶序列或已知序列的结合蛋白质分子。

 

二、实验步骤

1、 蛋白的提取

浆蛋白核蛋白提取(细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒)

1.1 准备溶液:室温融解试剂盒中的三种试剂,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

1.2 对于贴壁细胞:用PBS洗一遍,用细胞刮子刮下细胞,或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

1.3 对于悬浮细胞:用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

1.4 对于新鲜组织:

1.1 

1.2 

1.3 

1.4 

1.4.1 把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液,并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。

1.4.2 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内,冰浴放置15分钟。

1.4.3  4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中,为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)

1.4.4 对于沉淀,到了这一步已经充分匀浆,但很多细胞还没有破碎。

1.4.5 

1.4.6 

1.4.7 

1.4.8 

1.4.9 

1.4.10 

1.4.11 

1.4.12 

1.4.13 

1.4.14 

1.4.15 

1.4.16 

1.4.17 

1.4.18 

1.4.19 

1.4.20 

1.4.21 

1.4.22 

1.4.23 

1.4.24 

1.4.25 

1.4.26 

1.4.27 

1.4.28 

1.4.29 

1.4.30 

1.4.31 

1.4.32 

1.4.33 

1.4.34 

1.4.35 

1.4.36 

1.4.37 

1.4.38 

1.4.39 

1.4.40 

1.4.41 

1.4.42 

1.4.5 每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞,其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)

1.1 

1.2 

1.3 

1.3.1 

1.3.2 

1.3.3 

1.3.4 

1.3 

1.3.4 

1.4 

1.4.1 

1.4.2 

1.4.3 

1.4.4 

1.4.6 最高速剧烈Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)

1.4.7 冰浴10-15分钟。

1.4.8 加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1分钟。

1.4.9 最高速剧烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。

1.4.10 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。)

1.4.11  对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

1.4.12  最高速剧烈Vortex 15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。

1.4.13  4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。

1.5  每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞,其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)

1.6  最高速剧烈Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)

1.7  冰浴10-15分钟。

1.8  加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1分钟。

1.9  最高速剧烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。

1.10  立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。)

1.11  对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

1.12  最高速剧烈Vortex 15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。

1.13  4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。

1.14  立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃冻存。

2、 制胶  (1.5mm胶,大约30分钟胶会凝)

试剂

浓度5.5%

H2O         ml

7.50

10*TBE       ul

500

40%丙烯酰胺   ml

1.50

50%甘油      ul

500

10%AP       ul

50

TEMED        ul

10

总体积       ml

10

待胶完全凝固后120v预电泳1h,缓冲液用预冷的0.5×TBE。

3、 蛋白与探针反应(注:蛋白浓度1 ug/uL ,上样体积2 uL)

试剂名称

阴性对照

样品组

冷竞争

10×binding buffer

2

2

2

1ug/ul polydl.dc

1

1

1

50glycerol

1

1

1

1%NP-40

1

1

1

100m M Mgcl

1

1

1

200m M EDTA

1

1

1

Protein

-

+

+

标记探针(200 fmol

+

+

+

未标记探针(40 pmol)

0

0

+

H2O

+

+

+

总体积

20

20

20

混合后室温放置20分钟。

4、 上样

预电泳完后马上更换预冷的电泳缓冲液,加5ul的5×上样缓冲液到样品混合液中,马上上样电泳。180v ,60min。

5、 电转移

将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10分钟。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE。300m A 30分钟。

6、 交联

转膜完成后将膜取出,放在一张干净的滤纸上,做好标记。于紫外灯下20cm处作用20分钟。

7、 封闭

将交联完成的尼龙膜取出放入洗净的孵育槽,用封闭液封闭20分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇)。

8、 抗体反应

   倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后,与膜完全作用30分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇).

9、 洗脱

        用1×的洗脱液清洗3次,每次5分钟。摇床速度加大。

10、平衡

用平衡液平衡5分钟。

11、ECL发光检测

12、图像分析(灰度比分析结果见EXCEl表格)